Desktop Tower Defense spilles på et kort, der ligner et kontorbord. Spilleren skal forhindre et bestemt antal fjender, kendt i genren som "creeps", i at nå et bestemt punkt på spillepladen. Dette opnås ved at bygge og opgradere tårne, der skyder på, skader og dræber de fjendtlige creeps, før de er i stand til at nå deres mål. I modsætning til mange andre tower defense-spil er creepsenes vej ikke forudbestemt; i stedet bestemmer de byggede tårne creepsenes vej, som tager den korteste vej, de kan finde, til udgangen. Spillet tillader ikke spilleren at gøre en udgang fuldstændig utilgængelig, men centrale strategier handler om at guide creeps ind i lange, snoede korridorer.